The GCI’s Histology Innovation Platform

Sous la direction de notre pathologiste Dre Marie-Christine Guiot (MD), nos techniciens en histologie qualifiés offrent des services d'histotechnologie de premier ordre aux utilisateurs de McGill, du milieu universitaire et du secteur privé. Vos échantillons sont traités rapidement sous un contrôle de qualité rigoureux.

Notre plateforme est équipée pour fournir des services histologiques généraux, y compris la coupe, ainsi que des services spécialisés comme la coloration IHC, des colorations spéciales personnalisées, des TMA et des solutions de pathologie numérique.

Notre mission est d'offrir des services de haute qualité de façon efficace et économique afin de faire progresser votre recherche scientifique. Votre satisfaction est notre objectif sincère.

La plateforme d'histologie est conçue pour faciliter les services d'histologie sur une grande variété de tissus, de cellules et d'organoïdes provenant de mammifères, de plantes, d'insectes et de poissons. Nos services vont de l'histologie de routine (incluant le traitement à la paraffine, l'enrobage, la coupe et la coloration H&E) à des prestations plus complexes.

Les services comprennent :

• La préparation biologique des tissus et des cellules pour le traitement, l'enrobage et la coupe, tant pour les échantillons à la paraffine que congelés.
• La coloration d'échantillons biologiques, y compris l'immunohistochimie et les colorations spéciales.
• La conception et la fabrication de microréseaux tissulaires (TMA).
• La pathologie numérique : numérisation de lames pour un stockage et une analyse efficaces.
• La formation aux techniques histologiques.
• L'accès à des instruments pouvant être réservés.
• La consultation et l'optimisation de projets.

Échantillons à la paraffine

La plateforme d'histologie propose une vaste gamme de services sur paraffine pour répondre au mieux à divers besoins. Le processus de paraffinage permet de déshydrater les tissus et les cellules avant d'infiltrer l'échantillon avec de la paraffine et de procéder à son enrobage.

Les échantillons fixés au formol et enrobés de paraffine (FFPE) offrent une grande stabilité lors de la coupe et constituent un moyen idéal de conserver les spécimens à long terme. Toutes les colorations ne sont pas compatibles avec les échantillons FFPE; il est recommandé de vérifier auprès du personnel ou de consulter le site web pour confirmer la compatibilité de votre coloration.

Décalcification

La décalcification est couramment employée pour les échantillons osseux. Après fixation, les échantillons osseux subissent une décalcification qui retire les minéraux de l'os, contribuant ainsi à améliorer la qualité des coupes osseuses.

Si votre étude nécessite l'évaluation de la minéralisation osseuse, cette technique pourrait ne pas convenir.

Traitement à la paraffine

Le traitement est essentiel pour les blocs FFPE, car il garantit que les échantillons sont prêts pour la coupe. Le traitement comporte trois étapes : 1) la déshydratation de l'échantillon à l'EtOH, 2) l'éclaircissement de l'échantillon au xylène et 3) l'infiltration des échantillons avec de la cire de paraffine. Une fois infiltrés de paraffine, les échantillons durcissent, ce qui permet de les couper au microtome. Le traitement des échantillons assure la préservation de l'architecture tissulaire.

Si vos échantillons contiennent des plastiques ou des microplastiques à préserver, une méthode de traitement alternative doit être employée. Veuillez en informer les techniciens de la plateforme lors du dépôt de vos échantillons afin que nous puissions les préparer en conséquence.

Enrobage à la paraffine

L'enrobage à la paraffine a lieu après le traitement. Cette étape génère des blocs de tissu, où les tissus ou cellules traités sont orientés correctement pour la coupe et entourés de paraffine solidifiée. Les blocs de paraffine peuvent ensuite être coupés. Les échantillons enrobés de paraffine sont excellents pour le stockage à long terme ou l'archivage.

Coupe à la paraffine

Les coupes à la paraffine sont réalisées à l'aide d'un microtome. Les blocs sont d'abord dégrossis pour exposer le tissu ou la zone d'intérêt, puis des coupes d'épaisseurs variées sont prélevées et placées dans un bain-marie pour s'aplanir et se détendre avant d'être recueillies sur des lames. Les lames sont séchées pendant la nuit à 37 degrés Celsius, assurant une bonne adhérence sur la lame.

Différents types de coupes peuvent être effectués. Les coupes sériées non colorées sont des coupes séquentielles, les coupes étagées (STEP) sont espacées d'une distance définie, et des coupes en rubans (scrolls) peuvent être réalisées pour l'extraction d'ADN ou d'ARN.

Coupes en rubans (scrolls)

Des coupes en rubans peuvent être prélevées au cryostat et utilisées pour l'extraction d'ADN ou d'ARN. Les coupes en rubans sont recueillies dans des tubes stériles et peuvent être effectuées dans des conditions exemptes de RNase.

Échantillons congelés

La plateforme d'histologie est équipée pour traiter des échantillons congelés, qu'ils soient congelés frais ou qu'ils aient subi une fixation et une cryoprotection. Les échantillons peuvent être reçus pour être enrobés par le personnel de la plateforme ou être préalablement enrobés avant leur dépôt.

Les échantillons congelés préservent la structure des lipides et permettent la conservation de l'ADN/ARN ainsi que de certains épitopes. Après l'enrobage en OCT, les échantillons doivent être conservés à -80 degrés Celsius.

Enrobage en OCT

L'enrobage en OCT peut être utilisé pour fabriquer des blocs pour tout type d'échantillon congelé (frais congelé ou fixé et cryoprotégé). Lors de la préparation des blocs OCT, le personnel enrobe soigneusement les échantillons selon l'orientation souhaitée en évitant les bulles, garantissant ainsi des coupes de qualité.

Coupe congelée

Les coupes congelées sont recueillies sur des lames à l'aide d'un cryostat. Les blocs congelés sont d'abord dégrossis pour exposer la zone d'intérêt, puis les coupes sont immédiatement prélevées. Des échantillons de différentes origines biologiques peuvent être coupés; une désinfection aux UV est effectuée après chaque utilisation pour éviter toute contamination entre échantillons.

Différents types de coupes peuvent être réalisés. Les coupes sériées non colorées sont des coupes séquentielles, et les coupes étagées (STEP) sont espacées d'une certaine distance.

Coupes en rubans (scrolls)

Des coupes en rubans peuvent être prélevées au cryostat et utilisées pour l'extraction d'ADN ou d'ARN. Les coupes en rubans sont recueillies dans des tubes stériles et peuvent être effectuées dans des conditions exemptes de RNase.

Coloration histologique

La coloration histologique regroupe des techniques conçues pour mettre en valeur les structures cellulaires ou tissulaires. De nombreuses colorations peuvent être choisies pour accentuer des zones d'intérêt et offrir une connaissance plus approfondie de structures cellulaires ou tissulaires spécifiques. La coloration permet de diagnostiquer des pathologies ou d'évaluer les variations tissulaires entre différentes conditions expérimentales.

La coloration de loin la plus courante est la coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E). Les colorations H&E sont des outils précieux pour évaluer l'anatomie des tissus et sont souvent employées pour l'évaluation initiale par les pathologistes.

Veuillez cliquer ici pour obtenir un aperçu des colorations histologiques les plus courantes, de leurs indications et des informations fournies. D'autres colorations spéciales non listées peuvent être développées avec l'aide de nos techniciens de recherche. Veuillez contacter la plateforme pour discuter de la mise au point de la coloration souhaitée.

Immunohistochimie (IHC)

La plateforme d'histologie est équipée pour concevoir et réaliser des expériences d'IHC, d'immunofluorescence et d'hybridation in situ, ainsi que le démasquage antigénique à l'aide du système Ventana Discovery Ultra. Vous trouverez ci-dessous de plus amples informations sur l'IHC et le système Ventana Discovery Ultra, ainsi que des renseignements sur la réalisation d'expériences d'IHC avec la plateforme et la liste des marqueurs protéiques pour lesquels des protocoles d'IHC ont été développés.

Aperçu de l'immunohistochimie

L'immunohistochimie est utilisée pour détecter des marqueurs protéiques spécifiques dans les tissus ou les cellules. L'IHC est une technique de coloration faisant appel à des anticorps qui se lient aux marqueurs protéiques, révélant la présence de ces protéines dans le tissu et permettant de quantifier leurs niveaux d'expression.

L'IHC est un outil diagnostique majeur en milieu clinique, où elle sert souvent à évaluer les niveaux de biomarqueurs de référence dans les tissus. En clinique, elle peut aider au diagnostic d'une pathologie, à l'établissement du pronostic, à la prédiction de la réponse au traitement ou au suivi thérapeutique d'un patient.

Une autre application fréquente de l'IHC concerne la découverte de médicaments. L'IHC permet de s'assurer que les molécules candidates ciblent les bons récepteurs et de déterminer quelles conditions ou sous-types de pathologies un médicament est le plus apte à traiter. De plus, l'IHC peut être appliquée à n'importe quelle espèce si les anticorps réagissent adéquatement avec celle-ci. Cela permet d'évaluer les effets tant sur les modèles animaux utilisés que sur les échantillons de patients.

Fonctionnement de l'immunohistochimie

L'IHC comporte de nombreuses étapes, chacune étant indispensable pour visualiser les niveaux de protéines. Voici le déroulement des étapes courantes de la coloration par IHC et leur utilité :

1. Démasquage antigénique : La préparation des échantillons pour l'IHC (comme la fixation tissulaire) peut masquer les antigènes et limiter la liaison des anticorps. Le démasquage antigénique permet aux anticorps d'accéder aux antigènes dans le tissu.
2. Perméabilisation : Selon l'emplacement de l'antigène, les anticorps peuvent avoir besoin d'accéder à l'intérieur de la cellule. La perméabilisation est l'étape qui facilite cet accès intracellulaire.
3. Blocage : Cette étape permet de réduire le bruit de fond.
4. Anticorps primaire : L'anticorps se lie à l'antigène.
5. Anticorps secondaire : L'anticorps se lie à l'anticorps primaire. Une enzyme couramment utilisée pour la détection est la peroxydase de raifort (HRP), qui est couplée à l'anticorps secondaire.
6. Chromogène : Le chromogène permet de visualiser l'anticorps secondaire et ainsi l'antigène d'intérêt. Le chromogène le plus utilisé est le DAB, qui colore en brun les zones contenant l'antigène.
7. Contre-coloration : Les tissus sont souvent contre-colorés à l'hématoxyline, conférant au fond une teinte bleue. Cela crée un contraste et facilite la détection visuelle du chromogène.

Avantages de l'utilisation du Roche Ventana Discovery Ultra

La plateforme d'histologie est équipée d'un Roche Ventana Discovery Ultra, un automate de coloration pour immunohistochimie (IHC). La coloration IHC automatisée et le système Ventana Discovery Ultra offrent de nombreux avantages :

1. Haut débit : 30 lames peuvent être traitées simultanément dans le Ventana. Chacune de ces 30 lames peut être colorée avec le même anticorps, ou chaque piste peut recevoir un protocole distinct, le tout avec un minimum d'intervention. De plus, l'appareil peut fonctionner la nuit pour accroître le débit. Ces caractéristiques accélèrent l'optimisation des protocoles et améliorent l'efficacité de la coloration.
2. Gain de temps : L'automatisation de la coloration IHC améliore l'efficacité de votre travail. Le Ventana colore les lames rapidement en réduisant les interventions manuelles, ce qui vous fait gagner du temps. Comme les résultats du Ventana sont constants et fiables, les chercheurs peuvent mieux organiser leurs expériences.
3. Diminution de la variabilité et reproductibilité : 30 lames peuvent être traitées au sein d'un même lot. Le processus étant automatisé, la variabilité inter-lots est considérablement réduite. De plus, le personnel de la plateforme inclut des tissus témoins optimisés pour s'assurer du bon déroulement des expériences. La coloration IHC nécessite le maintien de températures précises et distinctes selon les étapes, lesquelles sont régulées automatiquement dans le Ventana, réduisant ainsi les fluctuations susceptibles d'altérer les résultats.
4. Personnalisation des colorations : L'un des principaux atouts du système Discovery Ultra est la possibilité constante de créer, d'adapter et de mettre à jour des protocoles. Chaque étape de l'expérience peut être modifiée pour obtenir les meilleurs résultats. Lors du développement d'un nouveau protocole ou essai, de nombreuses conditions différentes peuvent être testées simultanément afin de définir les paramètres optimaux.
5. Autres fonctionnalités permettant de gagner du temps : Le Ventana permet également aux chercheurs de réaliser automatiquement la cuisson des tissus, la déparaffinage et le démasquage antigénique. Ces premières étapes de l'IHC, de l'immunofluorescence et d'autres analyses sont chronophages et nécessitent un contrôle strict de la température. Le Ventana prend en charge une partie de ces tâches et fournit des tissus ayant subi un démasquage antigénique homogène et de haute qualité.

Réalisation de l'immunohistochimie à la plateforme d'histologie

La plateforme d'histologie dispose de nombreux protocoles développés pour la coloration avec différents anticorps. Vous trouverez ci-joint la liste des protéines pour lesquelles des protocoles existent déjà, ainsi que, le cas échéant, le fabricant ou le nom de l'anticorps recommandé. Bien que cette liste soit étendue, il est possible qu'aucun protocole ne soit encore établi pour la protéine que vous souhaitez étudier. Si tel est le cas, veuillez nous contacter pour le développement d'un protocole IHC.

Le développement d'un protocole IHC repose sur une collaboration entre vous, la plateforme et notre pathologiste. Si vous souhaitez utiliser un anticorps pour un marquage IHC, transmettez sa fiche technique à la plateforme. Veuillez préciser sur quel tissu vous travaillez, ainsi que quelques détails sur votre projet et les résultats attendus. La plateforme consultera notre pathologiste afin d'établir les conditions d'essai idéales pour tester le protocole sur des échantillons de tissus témoins. Une fois la coloration IHC effectuée, les numérisations numériques seront transmises à notre pathologiste pour valider la qualité du marquage. Si la coloration est approuvée, nous passerons à vos échantillons. Si elle n'est pas approuvée, nous reprenons les démarches pour un nouveau cycle d'optimisation. Le développement d'un protocole n'est réalisé qu'une seule fois par anticorps : une fois mis au point, il est conservé par la plateforme pour les utilisations futures.

Microréseaux tissulaires (TMA)

Les microréseaux tissulaires (TMA) permettent l'analyse moléculaire à haut débit d'un grand nombre de tissus. Les TMA sont obtenus en prélevant de petites carottes dans des blocs de cellules ou de tissus inclus en paraffine, puis en les insérant dans un bloc de paraffine receveur selon votre configuration. Le bloc receveur de TMA peut contenir plus de 550 carottes, ce qui permet d'étudier simultanément l'ensemble de ces échantillons tissulaires.

Avantages de la création d'un TMA

L'utilisation de TMA présente de nombreux avantages :

1. Utilisation optimale du tissu : Des carottes de seulement 0,6 mm de diamètre peuvent être prélevées sur les échantillons. Cela limite la quantité de tissu consommée, un point essentiel pour les tissus rares ou les biopsies. Au lieu de couper et d'utiliser une section entière de tissu à chaque analyse, une petite carotte est prélevée pour le TMA, laissant le reste du tissu disponible pour de futures coupes ou pour d'autres TMA.
2. Utilisable sur des échantillons d'archives : Le tissu employé pour les TMA est inclus en paraffine, ce qui est idéal pour la conservation à long terme. Les TMA peuvent ainsi être créés à partir de blocs d'archives, préservant ainsi la matière de ces spécimens.
3. Prélèvement des carottes ciblé selon la zone d'intérêt : Avant de préparer le TMA, une coupe du tissu peut être réalisée et colorée à l'H&E. Cette lame H&E aide à repérer la zone d'intérêt, qui peut ensuite être marquée sur le tissu pour un prélèvement précis lors de la fabrication du TMA.
4. Analyse simultanée : L'ensemble des tissus du TMA tient sur une seule lame de microscope, garantissant une analyse uniforme. Cela élimine les variations inter-séries lors des colorations et permet une comparaison rigoureuse des tissus.
5. Rentabilité : L'analyse simultanée de multiples spécimens permet de couper, colorer et imager jusqu'à 550 échantillons différents en même temps. Cette approche est particulièrement avantageuse pour les colorations spéciales coûteuses, l'IHC, l'immunofluorescence ou la pathologie numérique.

Les TMA ont apporté une contribution majeure au domaine médical, notamment dans la recherche sur le cancer et la découverte de médicaments. En oncologie, ils servent à mettre au point des tests diagnostiques et à étudier les biomarqueurs tumoraux. Dans le développement pharmaceutique, les TMA sont souvent utilisés pour évaluer de nouvelles cibles thérapeutiques, notamment en étudiant l'expression génique dans des tissus pathologiques, en criblant et validant des cibles potentielles, et ils constituent un outil précieux pour le contrôle de la qualité.

Grâce à l'automate TMA GrandMaster, la plateforme d'histologie peut vous aider à concevoir et préparer des TMA selon vos besoins. Pour en savoir plus sur les spécifications du TMA GrandMaster, veuillez consulter la section consacrée aux instruments.

Construction d'un TMA

Pour construire un TMA, un plan de TMA doit d'abord être créé. Le plan de TMA contient tous les identifiants de blocs correspondant à l'emplacement où la carotte de chaque bloc sera insérée dans le bloc receveur du TMA. Nous recommandons que le plan de TMA ne soit pas symétrique, afin de s'assurer que le TMA et son plan correspondent facilement et que l'orientation ne soit jamais confondue. Veuillez trouver ci-dessous un exemple de plan de TMA.

Une fois le plan de TMA généré, les blocs peuvent être chargés dans le TMA Grandmaster avec le bloc receveur. Nos techniciens prépareront l'appareil, veilleront à ce que chaque image de bloc soit étiquetée et sélectionneront la zone tissulaire appropriée pour le prélèvement de la carotte. L'appareil perforera les carottes et les transférera dans le bloc receveur selon le plan de TMA. Une fois toutes les carottes insérées dans les blocs receveurs, nos techniciens ramolliront délicatement la paraffine du bloc receveur pour permettre aux carottes d'y adhérer et éviter qu'elles ne se détachent. Les TMA peuvent ensuite être coupés en toute sécurité pour des analyses ultérieures.

Nous recommandons de manipuler les TMA avec précaution. Il est conseillé d'envelopper le TMA dans une lingette Kimwipe ou un papier tissu et de le conserver dans un endroit sûr.

Pathologie numérique, numérisation de lames

La pathologie numérique est le processus d'acquisition, de gestion, de partage et d'interprétation de l'information pathologique. Pour soutenir ces objectifs, la plateforme est équipée d'un numériseur à fond clair à haut débit, permettant l'acquisition de lames à haute résolution, qui peuvent être facilement stockées et conservées pour une utilisation ultérieure, pour l'analyse, pour l'utilisation dans des logiciels numériques et envoyées à des collaborateurs à travers le monde.

Le Nanozoomer S210 est un numériseur à fond clair récemment acquis. Le numériseur peut saisir des images haute résolution de lames colorées à l'H&E, en IHC ou avec des colorations spéciales. Deux objectifs peuvent être utilisés, soit 20x ou 40x, pour capturer les images. Le numériseur peut contenir 210 lames simultanément pour une numérisation efficace et fiable.

Le Nanozoomer dispose de capacités uniques d'empilement Z qui peuvent être utilisées lors de l'acquisition d'images d'échantillons plus épais.

Une fois les images générées, elles peuvent être récupérées par les utilisateurs à l'aide d'un disque dur externe ou partagées à distance via Microsoft SharePoint.

Les lames numériques peuvent être ouvertes à l'aide de deux visionneuses gratuites différentes, les liens pour télécharger chaque logiciel se trouvent ci-dessous.

NDP.View2 (compatible avec Mac et PC) :

https://www.hamamatsu.com/eu/en/product/life-science-and-medical-systems/digital-slide-scanner/U12388-01.html

ImageScope (compatible avec PC) :

https://www.leicabiosystems.com/en-ca/digital-pathology/manage/aperio-imagescope/

Pour l'analyse de vos lames, l'outil à code source ouvert gratuit, QPath, est recommandé. QPath permet l'analyse de lames entières avec des fonctionnalités comprenant, sans s'y limiter, des algorithmes de détection des tissus et des cellules, des fonctions d'annotation, et prend en charge les images à fond clair et en fluorescence.

https://qupath.github.io

Formation

Que vous cherchiez à développer de nouvelles compétences ou à perfectionner votre technique actuelle, nos techniciens sont là pour vous aider.

Les services de formation sont pratiques et offerts en petites sessions de groupes ne dépassant pas trois personnes. Tous les outils et équipements nécessaires à la formation seront fournis, ainsi que des spécimens pour pratiquer. Si vous travaillez avec un type de tissu particulier ou si vous avez des échantillons sur lesquels vous souhaitez vous exercer pendant la séance de formation, vous êtes libre de les apporter.

Les séances de formation suivent généralement cette structure :

Présentation du laboratoire, de l'emplacement des équipements et des postes de premiers soins importants. Suivie d'une introduction à l'appareil, mettant en évidence les caractéristiques de sécurité et les règles relatives à l'appareil. Les techniciens feront ensuite une démonstration de l'utilisation de l'appareil, en expliquant en détail ce qui est fait. Les personnes formées s'exerceront ensuite à utiliser l'équipement avec le soutien des techniciens de la plateforme, qui fourniront des conseils et des suggestions. Une fois que la personne formée aura acquis de l'assurance, les techniciens de la plateforme continueront d'observer pour s'assurer qu'elle est en mesure de faire fonctionner l'appareil de manière autonome et sécuritaire.

Une fois la formation terminée, les personnes formées pourront réserver l'équipement et l'utiliser de façon autonome. Des techniciens seront présents à la plateforme pour répondre aux questions ou fournir une assistance supplémentaire au besoin.

Pour accéder à tout équipement de la plateforme d'histologie, tous les utilisateurs doivent être formés par un technicien de la plateforme d'histologie, ce qui garantit la sécurité de l'utilisateur et la protection de l'équipement.