Microscope confocal à balayage laser - Zeiss LSM710

Le MCBL utilise une source lumineuse ponctuelle (laser) et un sténopé (pinhole) pour éliminer la lumière hors foyer. Il permet le sectionnement optique d'échantillons marqués par fluorescence afin d'offrir une vue tridimensionnelle de la structure.

Principales applications du microscope :

1. Examiner des échantillons marqués par fluorescence pour la localisation simple ou multicolore de molécules dans les cellules ou les tissus.

2. Réaliser des études physiologiques telles que l'imagerie ratiométrique et l'enregistrement accéléré (time-lapse) de cellules ou tissus vivants.

3. La photomanipulation du signal de fluorescence (p. ex. FRAP (recouvrement de fluorescence après photoblanchiment), FLIP (perte de fluorescence en imagerie après photoblanchiment), photoactivation/photocommutation, etc.) pour étudier la cinétique des molécules dans les cellules vivantes.

Ce système est principalement utilisé pour la détection de marquages fluorescents sur des échantillons fixés. Toutefois, il est également équipé des accessoires requis (contrôle de la température, du CO2, du O2) pour l'imagerie de cellules vivantes. De plus, le système comprend un module FCS qui permet également l'imagerie à l'aide du détecteur sensible à photodiode à avalanche (APD, Zeiss Confocor 3, voir la section FCS).

L'instrument est muni d'un détecteur spectral utilisant un réseau de PMT (tubes photomultiplicateurs) et des éléments de réseau optique pour recueillir l'information spectrale des fluorophores. Des données spectrales de 405 nm à 720 nm avec un pas de 10.7 nm peuvent être détectées grâce à cette configuration. Ensuite, à l'aide de l'outil de déconvolution spectrale non linéaire intégré, les signaux issus de différents fluorophores peuvent être séparés mathématiquement. Le système élimine le besoin de filtre d'émission et offre l'avantage de pouvoir séparer des fluorophores dont les spectres d'émission se chevauchent largement. Par exemple, la GFP et l'YFP peuvent être séparées avec cette configuration (ce qui est impossible avec un système d'imagerie conventionnel à base de filtres). Le système s'avère aussi particulièrement utile pour imager des échantillons fortement autofluorescents en microscopie de fluorescence, car l'autofluorescence présente une signature spectrale très différente de celle des fluorophores.

Infos LSM 710 :

Microscope : Zeiss AxioObserver (inversé)
Objectifs :
10x 0.45NA EC Plan-Neofluar
20x 0.8NA Plan-Apochromat
40x 1.3 huile Plan-Apochromat
40x 1.2NA Eau C-Apochromat
63x 1.4NA Huile DIC Plan-Apochromat

Lignes laser
Diode 405 nm
Diode 440 nm
Argon : 458, 488, 514 nm
Solide : 561 nm
HeNe : 633 nm

Détecteurs
3 PMT de fluorescence, 1 PMT de transmission et 2 APD

Référence : http://www.graduate-studies-in-cancer-research.org/CIF/CIFequip1.htm