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Il s'agit d'un système complexe aux capacités multiples. C'est :
1) Un microscope à super-résolution avec STED (STimulated Emission Depletion) capable d'obtenir des images de fluorescence avec une résolution allant jusqu'à <50 nm.
2) Un microscope multiphotonique avec un laser accordable de 680-1064 nm.
3) Un système d'imagerie du temps de vie de fluorescence dans le domaine temporel pour les mesures de FLIM.
4) Un système de spectroscopie de corrélation de fluorescence pour détecter les associations moléculaires.
5) Une combinaison d'optiques et de module logiciel capable d'obtenir des images de fluorescence jusqu'à ~120 nm.
Le STED utilise un laser de déplétion en forme de beigne pour modifier la fonction d'étalement du point du faisceau sous la limite de diffraction, afin d'atteindre une microscopie à super-résolution inférieure à 50 nm (lien principe STED). Le système est équipé de lasers de déplétion à 594 nm, 660 nm et 775 nm pour une variété de fluorophores. Pour des détails sur le système, veuillez visiter ce site Web : Leica STED.
Le microscope multiphotonique utilise un laser à impulsions ultrarapides pour exciter les molécules fluorescentes. En bref, la microscopie à 2 (multi-)photons repose sur le principe qu'une molécule fluorescente donnée, qui ne serait normalement excitée qu'en absorbant l'énergie d'un seul photon d'une certaine longueur d'onde, peut également être excitée par la combinaison des énergies produites par l'absorption simultanée de 2 (ou plusieurs) photons de plus faible énergie d'une longueur d'onde double (multiple). L'émission de fluorescence dépend de manière quadratique de l'intensité d'excitation. Cette forte dépendance du taux d'absorption envers la concentration de photons confère au microscope confocal à balayage laser multiphotonique une résolution tridimensionnelle intrinsèque, avec une profondeur de champ définie par a) l'intensité de la lumière d'excitation, b) l'ouverture numérique de l'objectif utilisé et c) les longueurs d'onde des lumières. Cette résolution z est comparable à celle d'un microscope confocal à balayage laser classique.
Des cellules COS ont été marquées avec un anticorps dirigé contre une protéine du pore nucléaire conjugué au colorant Star635P, puis imagées en confocal (haut) et en STED (bas) sur le même plan optique pour démontrer le gain de résolution avec le STED (barre d'échelle 2 um).
Le multiphoton offre des avantages notables par rapport au microscope confocal :
La longueur d'onde d'excitation plus longue permet d'imager plus profondément dans les échantillons épais grâce à une diffusion réduite de la lumière à plus grande longueur d'onde (IR).
Le photoblanchiment et les dommages sont confinés aux seuls points focaux.
Il est possible d'imager des colorants UV avec de la lumière infrarouge. Cela s'avère particulièrement utile pour l'imagerie de cellules vivantes, où la lumière UV est très dommageable pour les cellules.
La microscopie multiphotonique est donc particulièrement adaptée à l'imagerie d'échantillons vivants et épais.
Le système peut également mesurer le temps de vie de fluorescence à l'aide des lasers pulsés intégrés. Il est doté d'un laser blanc pulsé accordable en continu de 470 à 690 nm, en plus du laser IR dont la plage d'accord va de 680 à 1024 nm. De plus, le système permet de réaliser de la spectroscopie de corrélation de fluorescence, de la déconvolution et de l'imagerie à haute vitesse.
Il s'agit d'un système Leica Falcon SP8 avec STED (Leica_Falcon) équipé d'un laser femtoseconde Spectra-Physics (Insight, Newport Inc.). Doté des optiques suivantes :
Info Leica SP8 Falcon STED :
Microscope : Leica SP8 (inversé)
Objectifs :
5x 0.15NA HC Plan-Fluotar
10x 0.4 NA HC Plan Apo
25x 0.95NA Water HC Fluotar
86x 1.2NA Water HC Plan-Apo
100x 1.4NA Oil Plan-Apo
Lignes laser
Ti:Saphire : Deux faisceaux, un fixe à 1064 nm et un accordable de 680-1064 nm
Laser blanc II : longueur d'onde réglable en continu de 470 à 690 nm
Argon : 458, 488, 514 nm
Diode : 405 nm
Détecteurs
2 PMT, 3 détecteurs hybrides, 1 PMT en transmission
Référence : http://www.graduate-studies-in-cancer-research.org/CIF/CIFequip2.htm
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