PerkinElmer Ultraview ERS FRAP

Système confocal à disque rotatif (PerkinElmer Ultraview ERS)

Le système PerkinElmer UltraVIEW (PerkinElmer Life Sciences Inc., MA, USA) est un système confocal à disque rotatif de Nipkow Yokogawa (Yokogawa Corp. Japon). Il utilise un disque rotatif doté de multiples trous d'épingle pour obtenir la confocalité (c.-à-d. le rejet de la lumière hors foyer). Le disque de Nipkow désigne un disque de balayage percé de spirales symétriques de trous d'épingle à travers lesquels passe la lumière d'illumination. Ces trous divisent la lumière incidente en multiples « minifaisceaux ». Lorsque le disque tourne, la lumière balaie l'échantillon selon une trame. La lumière d'émission provenant de l'échantillon est détectée à travers le trou d'épingle pour générer une image confocale qui peut être enregistrée (à l'aide d'une caméra EMCCD (dispositif à transfert de charge à multiplication d'électrons)). Comme les trous d'épingle d'un disque de Nipkow doivent être espacés d'au moins 10 diamètres pour éviter l'interférence optique, le débit lumineux des disques de Nipkow classiques n'est que d'environ 1 % de la lumière arrivant sur le disque. La tête de balayage Yokogawa a résolu ce problème grâce à un disque collecteur innovant contenant des microlentilles, placé devant le disque de Nipkow. Les microlentilles s'assurent que la majeure partie de la lumière éclairant le disque soit focalisée sur les trous d'épingle. L'efficacité de transmission passe ainsi d'environ 1 % à 70 % de la lumière incidente, ce qui permet d'illuminer l'échantillon avec une intensité suffisante.

Avantages du système UltraVIEW : Le système présente principalement 2 avantages par rapport à un microscope confocal à balayage laser conventionnel : une vitesse d'acquisition supérieure et une phototoxicité réduite. La microscopie confocale à balayage laser (LSCM) est un système à balayage séquentiel où un seul point de l'échantillon est illuminé à la fois, utilisant un détecteur ponctuel (tube photomultiplicateur (PMT)). Par conséquent, la LSCM requiert un numériseur coûteux et un traitement électronique pour la formation de l'image. Le système LSCM est donc relativement lent (typiquement 0,5 à 10 s/image, les balayages plus lents pouvant prendre jusqu'à une minute/image). En revanche, le système à disque de Nipkow utilise un disque de balayage multipoint et une caméra CCD refroidie agissant comme détecteur matriciel parallèle. Cela permet au système Nipkow d'acquérir des images à une fréquence beaucoup plus élevée (jusqu'à 360 images/s) qu'en LSCM (typiquement 0,5 à 1 image/s). De nombreux processus cellulaires rapides (p. ex. imagerie calcique, trafic vésiculaire) peuvent ainsi être suivis en temps réel. Surtout, il a été démontré que le système confocal à disque rotatif réduit la phototoxicité et le photoblanchiment jusqu'à 5 fois par rapport à la LSCM. Cette réduction découlerait de la division du faisceau laser en milliers de minifaisceaux.
Bien que le mécanisme exact de cette réduction de phototoxicité et de photoblanchiment fasse encore l'objet d'études, la microscopie confocale à disque rotatif s'impose de plus en plus comme l'instrument de choix pour l'imagerie de cellules vivantes. Le système est particulièrement performant pour des applications telles que la microscopie confocale 4D en temps réel, la signalisation calcique, le trafic vésiculaire et les études de protéines fluorescentes vertes.

Description du système : Le système est basé sur un microscope inversé Zeiss Axiovert 200M équipé des raies laser suivantes pour l'excitation des fluorophores : 404 nm, 440 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm et 633 nm. Il comprend un moteur de focalisation piézoélectrique et tous les accessoires nécessaires (température, CO2) pour l'imagerie rapide sur cellules vivantes. Le microscope est monté sur une platine motorisée de haute précision pour le suivi de positions multiples sur un même porte-échantillon. Ce système a été mis à niveau avec un module FRAP (recouvrement de fluorescence après photoblanchiment) en 2009.

Applications du système : Le système convient parfaitement à l'imagerie rapide sur cellules vivantes avec phototoxicité réduite. Il est particulièrement utile pour les séries temporelles 3D visant à suivre des événements cellulaires rapides, en raison de sa vitesse de focalisation et d'acquisition plus élevée que celle des autres systèmes de la plateforme. Grâce à son module FRAP, des expériences de FLIP, de FRAP et de photoactivation peuvent également être réalisées sur ce système.

Informations sur le système confocal à disque rotatif :
Microscope : Zeiss Axiovert 200M (inversé)
Objectifs :
10x 0.3NA EC Plan-Neofluar
20x 0.8NA Plan Fluar
40x 1.3 à immersion d'huile Plan-Neofluar
63x 1.2NA à immersion d'eau C-Apochromat
63x 1.4NA à immersion d'huile DIC Plan-Apochromat
100X 1.4NA à immersion d'huile DIC Plan-Apochromat
Raies laser
Diode : 405 nm
Diode : 440 nm
Argon : 458, 488, 514 nm
Solide : 561 nm
Solide : 633 nm
Détecteurs
Hamamatsu EMCCD 1Kx1K pixels de 8 um

Référence : http://www.graduate-studies-in-cancer-research.org/CIF/CIFequip3.htm