Préparé par Jeannie Mui et S Kelly Sears

Protocole d'ultracentrifugation

1. Récupérez vos échantillons par ultracentrifugation ou par d'autres moyens. Pour l'ultracentrifugation, centrifugez selon les besoins, versez le surnageant et ajoutez du milieu conditionné jusqu'à ce que tout le volume soit transformé en culot.
2. Lavez le culot pendant 30 min à 4 °C dans 2 à 3 mL de PBS 1X glacé, filtré stérile à 0.1 μm, sur un agitateur, suivi d'une autre centrifugation et d'un dernier lavage/centrifugation pour éliminer les protéines sécrétées et les autres composants.
3. Remettez le culot en suspension dans une solution fixatrice de glutaraldéhyde à 2.5 % dans un tampon cacodylate de sodium 0.1 M (la resuspension finale du culot dépend de la quantité de matériel de départ, du nombre de grilles MET que vous souhaitez utiliser et de la quantité de bactéries dans votre échantillon, 5 à 10 µL d'échantillon pour chaque grille MET). La concentration doit se situer autour de 1 à 5 μg/μL.
4. Transférez la suspension bactérienne dans un tube Eppendorf de 1.5 mL et conservez à 4 °C.
5. Apportez au FEMR pour la déshydratation et le séchage au point critique.

Préparation des lamelles recouvertes de poly-L-lysine

1. Une solution à 0.01 % (p/v) est recommandée pour recouvrir les lamelles de poly-L-lysine. Lors de l'application de la poly-L-lysine sur la surface, assurez-vous que toute la surface soit entièrement recouverte.
2. Après une incubation de cinq minutes, retirez l'excédent de solution de la lamelle avec du papier filtre.
3. Rincez la lamelle trois fois avec un grand volume d'eau distillée, en veillant à rincer abondamment. L'excès de solution de poly-L-lysine peut être toxique pour la cellule/bactérie.
4. Laissez sécher la lamelle à l'air libre à température ambiante ou à chaleur douce dans une étuve. Si elles sont protégées de la poussière, les lamelles recouvertes sont stables pendant deux semaines à 4 °C ou un an à -20 °C. Enveloppez hermétiquement les lamelles avec du Parafilm pour l'entreposage.

Directives de préparation des échantillons pour le MEB : Bactéries/cellules en suspension

1. Fixez les bactéries/cellules avec du glutaraldéhyde à 2.5 % dans du tampon cacodylate 0.1 M pendant un minimum de 30 à 60 minutes. La fixation à 4 °C peut améliorer la préservation de certains spécimens. Pour fixer, retirez la majeure partie du milieu liquide mais pas la totalité afin d' éviter le dessèchement de l'échantillon, qui altère l'ultrastructure. Lavez brièvement avec du PBS.
2. Les échantillons peuvent être fixés à nouveau dans du tétroxyde d'osmium à 1 % pendant 30 à 60 minutes supplémentaires. La post-fixation au tétroxyde d'osmium peut être supprimée en prolongeant la fixation primaire, c.-à-d. 24 à 72 heures à 4 °C avec le fixateur primaire. Avantage : moins de craquelures (causées par le retrait) pendant le séchage, car les échantillons sont moins fragiles.
3. Pipetez la suspension bactérienne sur une lamelle de verre circulaire de 12 mm recouverte de poly-L-lysine (voir ci-dessus) pendant 15 à 30 minutes. Ne laissez pas sécher l'échantillon.
4. Rincez trois fois avec le même tampon pendant cinq minutes par rinçage (l'échantillon peut être conservé jusqu'à 72 heures à 4 °C à cette étape avant la déshydratation).
5. Déshydratez la lamelle contenant les bactéries avec une série graduée d'alcool éthylique (éthanol):dH2O, c.-à-d. 30, 50, 70, 80, 90 et 100 % (x3) à température ambiante; 10 minutes pour chaque étape suffisent. Les spécimens peuvent être conservés toute la nuit à 4 °C dans l'éthanol à 70 % si nécessaire, et le processus de déshydratation peut être achevé le lendemain. Pour éviter le rétrécissement, ne laissez pas les échantillons dans l'éthanol 100 % pendant une période prolongée.
6. Après la deuxième déshydratation avec l'éthanol 100 %, transférez immédiatement les lamelles dans le Leica Microsystems EM CPD300 ou séchez chimiquement à l'aide d'hexaméthyldisilazane (HMDS). Utilisez le protocole ci-dessous pour la déshydratation CPD.

Image par Leica Microsystems.

• Métallisez les lamelles avec une couche de platine d'environ 5 nm d'épaisseur à l'aide du métalliseur Leica EM ACE600 et réalisez les images avec le FE-SEM Quanta 450.

Séchage chimique avec de l'hexaméthyldisilazane (HMDS)

1. Déshydratez la lamelle bactérienne avec une série graduée d'alcool éthylique (éthanol):hexaméthyldisilazane (HMDS), c.-à-d. 30, 50, 70, 80, 90 et 100 % (x3) à température ambiante; deux à trois heures par étape.